LIPOFECTAMINE 2000转染试剂的转染步骤

此实验程序旨在在24孔板中进行粘附细胞的瞬时或稳定转染。它旨在直接将复合物添加到生长培养基中。

1.转染前一天，用胰蛋白酶消化并计数细胞，然后铺板细胞，使转染当天的密度达到90％。将细胞接种在0. 5ml不含血清的正常生长培养基中。

2.对于每个孔中的细胞，使用50μl无血清培养基（例如OPTI-MEMⅠ培养基）稀释0.8μg-1.0μgDNA。可以分批准备多孔操作。

3.对于每个孔中的细胞，使用50μlOPTI-MEM I培养基稀释1μl-3μlLIPOFECTAMINE 2000试剂。将LIPOFECTAMINE 2000稀释后，在30分钟内将其与稀释的DNA混合。保持时间过长会减少活动。可以分批准备。

注意：即使用OPTI-MEMⅠ稀释LIPOFECTAMINE 2000，也可以在D-MEM中培养细胞。如果使用D-MEM作为LIPOFECTAMINE 2000的稀释液，请在5分钟内与稀释的DNA混合。

4.混合稀释的DNA（来自步骤2）和稀释的LIPOFECTAMINE 2000（来自步骤3）。在室温下孵育20分钟。

注意：溶液可能是浑浊的，但不会影响转染。该复合材料在室温下可保持稳定6小时。

表6.在24孔板中转染Invitrogen细胞系的推荐剂量表6

细胞系杀伤/孔（×1 0) LIPOFECTAMINE 2000试剂（µl）

CHO-S 1. 5 2. 5- 3. 0

COS-7L 0. 8 2. 5- 3. 0

293H，293F 2. 0 1. 5- 2. 0

5.将复合物直接添加到每个孔中，摇动培养板并轻轻混合。

注意：如果在无血清条件下转染，请使用含有血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在添加复合物之前，先除去生长培养基，然后用0. 5ml无血清培养基代替。

6.在37°C和5％CO2下孵育24-48小时。 4-5小时后无需去除复合物或更改培养基或更改生长培养基。转染活性不会降低。

7.将复合物添加至细胞后24-72小时，分析细胞提取物或进行原位细胞染色以检测报告基因的活性。这取决于细胞类型和启动子活性。为了稳定表达，在转染开始一天后将细胞传代到新鲜培养基中，并在两天后添加筛选抗生素。稳定表达需要几天或几周。

贴壁哺乳动物细胞的DNA转染步骤

此步骤专门设计为使用LIPOFECTAMINE，LIPOFECTIN，DMRIE-C或CELLFECTIN试剂转染6孔板中的粘附哺乳动物细胞。

使用这些试剂时，要获得最佳转染效率，必须优化条件。请参阅右侧的阳离子脂质体试剂和DNA优化步骤。健康，成长中的细胞和恒定的细胞密度对于可再现的结果至关重要。

1.转染前一天，对细胞进行胰蛋白酶消化，计数和铺板，以使细胞在转染当天达到70-90％的融合度。电镀和转染过程中避免使用抗生素。

2.对于每个细胞孔，在100μl无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ或D-MEM）中稀释1-2μgDNA。如果有多孔电池，则可以分批制备。

3.在每个孔中，用100μl无血清培养基稀释2-25μl阳离子脂质体试剂。对于阳离子脂质体试剂的每种稀释液，使用单独的试管。对于LIPOFECTIN，必须用OPTI-MEM I稀释，稀释后的溶液必须在室温下保持30分钟。

4.将稀释的DNA（步骤2））与稀释的脂质体试剂（步骤3））混合。在室温下孵育15分钟。

5.在转染前，用0. 8ml /孔的转染培养基洗涤细胞。转染培养基中可能含有血清。

6.使用转染培养基将复合物稀释至1ml /管的总体积。将稀释的复合物添加到细胞中。在5％CO2下于37°C孵育5小时。

7. 5小时后，将培养基的体积增加至正常体积。如果转染培养基不含血清，请添加血清以使最终浓度达到正常生长培养基的浓度。为了获得最佳的细胞生长，请用新鲜的完全培养基代替含有复合物的培养基。

8.转染后24-48小时，分析细胞提取物或进行原位细胞染色以检测报告基因的活性。这取决于细胞类型和启动子活性。为了稳定表达，在转染开始一天后将细胞传代到新鲜培养基中，并在两天后添加筛选抗生素。稳定表达需要几天或几周。

注意：在不同大小的培养皿中转染细胞时亚博vip ，请根据表面积改变细胞，DNA，转染试剂和培养基的数量。

阳离子脂质体试剂和DNA的优化步骤

当使用除LIPOFECTAMINE PLUS试剂以外的阳离子脂质体试剂进行转染时德甲注册 ，必须进行仔细的优化才能获得最佳的转染效率。该实验程序可以确定使用LIPOFECTIN，CELLFECTIN，DMRIE-C或LIPOFECTAMINE试剂所需的最佳脂质体试剂和DNA。

保持恒定的细胞密度以获得可重复的结果。阳离子脂质体试剂和DNA复合物在96孔板中制备（因为体积小），然后添加到在24孔板中生长的细胞中。转染的培养板设置如下：

1.在转染前一天将细胞置于24孔板中德甲下注 ，因此转染当天的细胞汇合率为70-90％。

2.在6个小的离心管中，根据下表，用无血清培养基稀释阳离子脂质体试剂（足以进行5孔细胞转染）。仅对于LIPOFECTIN试剂，必须将稀释剂在室温下孵育30分钟。

管/柱（µl）体积稀释介质（µl）体积阳离子脂质试剂

1 120 5

2 11 7. 5 7. 5

3 115 10

4 11 2. 5 1 2. 5

5 110 15

6 10 7. 5 1 7. 5

3.将25μl稀释的阳离子脂质体试剂（步骤2））添加到96孔板相应列的4孔中（如上图所示）。

4.在一个小的离心管中，将以下量的DNA添加到140μl无血清培养基中进行稀释。 （足以进行7孔细胞转染。）

管/行DNA（µg）

A 1. 4

B 2. 8

C 5. 6

D 8. 4

5.在96孔板中每6个孔（沿底部）中，从A管中取出20μl并添加。对试管B，C和D重复相同的步骤。如上图所示安排样品。在室温下孵育15分钟。

6.转染前，用新鲜的转染培养基洗涤细胞。在添加稀释的复合物之前，请先除去清洁溶液（步骤7）。

7.在装有DNA-阳离子脂质体试剂复合物的96孔板中，向每个孔中加入160μl转染培养基（有或没有血清）。稍微混合。建议在有或没有血清的情况下测试其活性。

8.将复合物添加到24孔板的细胞中。

[p53] 5％CO 2，在37℃下5小时。 5小时后，添加含血清的完全培养基拉菲游戏 ，使最终血清浓度等于正常生长培养基。为了获得最佳的细胞生长，请用新鲜的完全培养基代替含有复合物的培养基。

1 0.转染后24-48小时，分析细胞提取物或进行原位细胞染色以检测报告基因的活性。这取决于细胞类型和启动子活性。为了稳定表达，在转染开始一天后将细胞传代到新鲜培养基中，并在两天后添加筛选抗生素。稳定表达需要几天或几周。

注意：确定最佳条件后，可根据培养板表面积的增加线性扩大转染实验的范围。在6孔板上获得的优化条件已成功扩大到100mm平板。阳离子脂质体的推荐范围和DNA量如下所示。

表1 1.用于转染的LIPOFECTIN，CELLFECTIN，DMRIE-C或LIPOFECTAMINE试剂的剂量范围表11

培养皿DNA（µg）阳离子脂质试剂（µl）转染培养基体积

35毫米1-2 2-25 0. 8

60毫米3-6 6-75 2. 4

100毫米8-16 16-200

转染细胞的β-gal原位染色

1.该实验过程用于检测固定细胞中的β-gal表达。这是确定转染效率的便捷方法。该方法在从Sanes方法修改而来的6孔板上执行。对于不同大小的培养皿，根据培养板的表面积比例扩大或减少溶液量。此步骤可用于悬浮细胞。使用2×106转染的细胞（来自6孔板转染），轻轻离心细胞，并使用与培养板相同的方法冲洗细胞。轻柔地处理细胞，不要摇晃，并以尽可能低的速度离心。

液体存储：

将20mg / ml X-gal溶于二甲亚砜（-20℃，储存在聚丙烯试管中，避光）。

注：使用玻璃移液器或聚丙烯尖端对二甲基亚砜溶液进行定量。二甲基亚砜可以溶解聚苯乙烯。

50mM铁氰化钾（储存于4℃）。

50mM亚铁氰化钾（在4℃下储存）。

工作液：

定性溶液：含2％甲酰胺，0. 05％戊二醛D-PBS（在4℃储存）

制备方法如下：

85ml蒸馏水

不含钙和镁的10毫升10X D-PBS（货号14200-07 5）（27mM KCl，11mM KHPO4，1. 4mM NaCl质粒转染浓度，81mM Na2HPO4·7H2O）

5ml福尔马林（37％甲醛溶液）

0. 2ml戊二醛（25％溶液）

染料溶液：D-PBS含有5mM铁氰化钾，5mM亚铁氰化钾，2mM氯化镁（在4°C下储存）。

制备方法如下：

70ml蒸馏水

10ml 10×D-PBS

10ml 50mM亚铁氰化钾

10ml 50mM铁氰化钾

0. 2ml 1M氯化镁

底物/染料溶液：染料溶液中含有1mg / ml X-gal

以下试剂可供使用：

20ml染料溶液

1ml X-gal（20mg / ml）

步骤：

1.用质粒pCMV·SPORT-βgal转染并表达超过24小时。

2.每孔用2ml含钙和镁的D-PBS洗涤细胞一次（货号14040-13 3）。

3.在室温下用1ml固定剂固定细胞5分钟。

4.用2ml D-PBS清洗每孔两次。

5.向每个孔中加入1ml底物/染料溶液，并在室温或37°C下孵育2小时至过夜。

6.在每个孔中加入2ml D-PBS冲洗，在倒置显微镜下观察细胞，并估计蓝色细胞（β-gal阳性）的比例。

7.为了保存培养板，向每个孔中加入1ml含10％福尔马林的PBS，并在室温下放置10分钟。用D-PBS冲洗并在4°C下储存在PBS中。

测定转染细胞提取物中β-gal的表达

该实验方法用于确定细胞提取物中的β-gal活性。可以测量从96孔板转染到100mm培养皿中获得的活性。此方法可以应用于悬浮细胞（有关注释，请参阅步骤2）。

解决方案

裂解液：0. 1％Triton X-100 / 0. 1M Tris-HCl（pH 8. 0）。

450毫升蒸馏水

50ml 1M Tris-HCl（pH 8. 0）

0. 5毫升Triton X-100洗涤剂

100×Mg溶液

0. 1M氯化镁

4. 5M 2-巯基乙醇

保存在4℃

0. 1M磷酸钠（pH 7. 5）

41ml 0. 2M Na2HPO4

9ml 0. 2M NaH2PO4

50ml蒸馏水

将4mg / ml ONPG（邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷）溶解在0. 1M磷酸钠中，该磷酸钠含2mM 2-巯基乙醇（pH 7. 5），在4℃下储存）。

1M碳酸钠水溶液

使用GENETICIN®筛选抗生素以筛选稳定的转染菌株

进行筛选所需的GENETICIN抗生素的量将随细胞类型，培养基和血清成分而变化。另外，如果您使用的是粉末状的GENETICIN抗生素，则由于滴度会波动，因此需要计算每批抗生素的剂量。或使用GENETICIN抗生素溶液，其活性将为100％。

通常，使用浓度为100至1100μg/ ml的GENETICIN抗生素来选择稳定的转染菌株，并使用所选剂量的一半来维持培养抗性。转染前，使用细胞进行剂量反应分析，以确定杀死细胞的最低抗生素浓度。稍高的浓度可用于筛选稳定的转化子。

储备液的制备：50mg / ml

1.样本计算：

标签滴定度：700μg/ mg

要制备10毫升质粒转染浓度，需要500毫克活性药物。因此，所需的总干重为714毫克。

2.重714毫克的GENETICIN抗生素。

3.溶于10毫升蒸馏水中。

4.无菌过滤。

或者，您可以使用滴定度为50mg / ml的活性抗生素的即用型溶液（无菌过滤）。

剂量反应分析：

1.准备不含青霉素或链霉素的完全培养基。

2.加入0至22μl50mg / ml的GENETICIN抗生素溶液（终浓度为0至1100μg/ ml的完全培养基，以100ug / ml的梯度递增）。

3.用胰蛋白酶消化细胞并稀释至4000细胞/ ml。

4.在6孔板的每个孔中加入100μl细胞悬液，并向每个孔中添加2ml含有稀释的GENETICIN抗生素的培养基。将培养板在加湿的5％CO2中于37°C孵育。每周两次用含有GENETICIN抗生素的新鲜培养基更换培养基。

5. 10到14天后，移出培养基，并用含有钙和镁离子的D-PBS洗涤细胞。将细胞用溶于50％甲醇的0. 5％亚甲蓝染色20分钟。

6.确定杀死所有细胞的最低浓度的GENETICIN抗生素。使用下一个较高的浓度进行筛选。

转染和筛选：

1.用含有抗生素抗性基因表达序列的质粒（例如pSV2neo）转染细胞。

2.转染后的第二天，向下传递细胞以提供细胞分裂的空间（取决于细胞的生长速度，通常可以达到1:10至1:40的效果）。

3.转染后2-3天，开始使用抗生素。将转染的细胞培养在含有抗生素的培养基中，并通过剂量反应分析确定抗生素的浓度。每周两次更换含有抗生素的培养基。

4. 10到14天后，可以观察到抗性克隆，并且未转染的对照应该没有细胞生长。耐药细胞可以根据需要进行固定，染色，传代或克隆。