转染和转染效率确定步骤

LIPOFECTAMINE 2000转染试剂的转染步骤

此实验程序旨在在24孔板中进行粘附细胞的瞬时或稳定转染。它旨在直接将复合物添加到生长培养基中。

1.转染前一天,用胰蛋白酶消化并计数细胞,然后铺板细胞,使转染当天的密度达到90%。将细胞接种在0. 5ml不含血清的正常生长培养基中。

2.对于每个孔中的细胞,使用50μl无血清培养基(例如OPTI-MEMⅠ培养基)稀释0.8μg-1.0μgDNA。可以分批准备多孔操作。

3.对于每个孔中的细胞,使用50μlOPTI-MEM I培养基稀释1μl-3μlLIPOFECTAMINE 2000试剂。将LIPOFECTAMINE 2000稀释后,在30分钟内将其与稀释的DNA混合。保持时间过长会减少活动。可以分批准备。

注意:即使用OPTI-MEMⅠ稀释LIPOFECTAMINE 2000,也可以在D-MEM中培养细胞。如果使用D-MEM作为LIPOFECTAMINE 2000的稀释液,请在5分钟内与稀释的DNA混合。

4.混合稀释的DNA(来自步骤2)和稀释的LIPOFECTAMINE 2000(来自步骤3)。在室温下孵育20分钟。

注意:溶液可能是浑浊的,但不会影响转染。该复合材料在室温下可保持稳定6小时。

表6.在24孔板中转染Invitrogen细胞系的推荐剂量表6

细胞系杀伤/孔(×1 0) LIPOFECTAMINE 2000试剂(µl)

CHO-S 1. 5 2. 5- 3. 0

COS-7L 0. 8 2. 5- 3. 0

293H,293F 2. 0 1. 5- 2. 0

5.将复合物直接添加到每个孔中,摇动培养板并轻轻混合。

注意:如果在无血清条件下转染,请使用含有血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在添加复合物之前,先除去生长培养基,然后用0. 5ml无血清培养基代替。

6.在37°C和5%CO2下孵育24-48小时。 4-5小时后无需去除复合物或更改培养基或更改生长培养基。转染活性不会降低。

7.将复合物添加至细胞后24-72小时,分析细胞提取物或进行原位细胞染色以检测报告基因的活性。这取决于细胞类型和启动子活性。为了稳定表达,在转染开始一天后将细胞传代到新鲜培养基中,并在两天后添加筛选抗生素。稳定表达需要几天或几周。

贴壁哺乳动物细胞的DNA转染步骤

此步骤专门设计为使用LIPOFECTAMINE,LIPOFECTIN,DMRIE-C或CELLFECTIN试剂转染6孔板中的粘附哺乳动物细胞。

使用这些试剂时,要获得最佳转染效率,必须优化条件。请参阅右侧的阳离子脂质体试剂和DNA优化步骤。健康,成长中的细胞和恒定的细胞密度对于可再现的结果至关重要。

1.转染前一天,对细胞进行胰蛋白酶消化,计数和铺板,以使细胞在转染当天达到70-90%的融合度。电镀和转染过程中避免使用抗生素。

2.对于每个细胞孔,在100μl无血清培养基(如OPTI-MEMⅠ或D-MEM)中稀释1-2μgDNA。如果有多孔电池,则可以分批制备。

质粒转染浓度_质粒转染细胞步骤_质粒转染

3.在每个孔中,用100μl无血清培养基稀释2-25μl阳离子脂质体试剂。对于阳离子脂质体试剂的每种稀释液,使用单独的试管。对于LIPOFECTIN,必须用OPTI-MEM I稀释,稀释后的溶液必须在室温下保持30分钟。

4.将稀释的DNA(步骤2))与稀释的脂质体试剂(步骤3))混合。在室温下孵育15分钟。

5.在转染前,用0. 8ml /孔的转染培养基洗涤细胞。转染培养基中可能含有血清。

6.使用转染培养基将复合物稀释至1ml /管的总体积。将稀释的复合物添加到细胞中。在5%CO2下于37°C孵育5小时。

7. 5小时后,将培养基的体积增加至正常体积。如果转染培养基不含血清,请添加血清以使最终浓度达到正常生长培养基的浓度。为了获得最佳的细胞生长,请用新鲜的完全培养基代替含有复合物的培养基。

8.转染后24-48小时,分析细胞提取物或进行原位细胞染色以检测报告基因的活性。这取决于细胞类型和启动子活性。为了稳定表达,在转染开始一天后将细胞传代到新鲜培养基中,并在两天后添加筛选抗生素。稳定表达需要几天或几周。

注意:在不同大小的培养皿中转染细胞时亚博vip ,请根据表面积改变细胞,DNA,转染试剂和培养基的数量。

阳离子脂质体试剂和DNA的优化步骤

当使用除LIPOFECTAMINE PLUS试剂以外的阳离子脂质体试剂进行转染时德甲注册 ,必须进行仔细的优化才能获得最佳的转染效率。该实验程序可以确定使用LIPOFECTIN,CELLFECTIN,DMRIE-C或LIPOFECTAMINE试剂所需的最佳脂质体试剂和DNA。

保持恒定的细胞密度以获得可重复的结果。阳离子脂质体试剂和DNA复合物在96孔板中制备(因为体积小),然后添加到在24孔板中生长的细胞中。转染的培养板设置如下:

1.在转染前一天将细胞置于24孔板中德甲下注 ,因此转染当天的细胞汇合率为70-90%。

2.在6个小的离心管中,根据下表,用无血清培养基稀释阳离子脂质体试剂(足以进行5孔细胞转染)。仅对于LIPOFECTIN试剂,必须将稀释剂在室温下孵育30分钟。

管/柱(µl)体积稀释介质(µl)体积阳离子脂质试剂

1 120 5

2 11 7. 5 7. 5

3 115 10

4 11 2. 5 1 2. 5

5 110 15

6 10 7. 5 1 7. 5

3.将25μl稀释的阳离子脂质体试剂(步骤2))添加到96孔板相应列的4孔中(如上图所示)。

4.在一个小的离心管中,将以下量的DNA添加到140μl无血清培养基中进行稀释。 (足以进行7孔细胞转染。)

管/行DNA(µg)

质粒转染浓度_质粒转染细胞步骤_质粒转染

A 1. 4

B 2. 8

C 5. 6

D 8. 4

5.在96孔板中每6个孔(沿底部)中,从A管中取出20μl并添加。对试管B,C和D重复相同的步骤。如上图所示安排样品。在室温下孵育15分钟。

6.转染前,用新鲜的转染培养基洗涤细胞。在添加稀释的复合物之前,请先除去清洁溶液(步骤7)。

7.在装有DNA-阳离子脂质体试剂复合物的96孔板中,向每个孔中加入160μl转染培养基(有或没有血清)。稍微混合。建议在有或没有血清的情况下测试其活性。

8.将复合物添加到24孔板的细胞中。

[p53] 5%CO 2,在37℃下5小时。 5小时后,添加含血清的完全培养基拉菲游戏 ,使最终血清浓度等于正常生长培养基。为了获得最佳的细胞生长,请用新鲜的完全培养基代替含有复合物的培养基。

1 0.转染后24-48小时,分析细胞提取物或进行原位细胞染色以检测报告基因的活性。这取决于细胞类型和启动子活性。为了稳定表达,在转染开始一天后将细胞传代到新鲜培养基中,并在两天后添加筛选抗生素。稳定表达需要几天或几周。

注意:确定最佳条件后,可根据培养板表面积的增加线性扩大转染实验的范围。在6孔板上获得的优化条件已成功扩大到100mm平板。阳离子脂质体的推荐范围和DNA量如下所示。

表1 1.用于转染的LIPOFECTIN,CELLFECTIN,DMRIE-C或LIPOFECTAMINE试剂的剂量范围表11

培养皿DNA(µg)阳离子脂质试剂(µl)转染培养基体积

35毫米1-2 2-25 0. 8

60毫米3-6 6-75 2. 4

100毫米8-16 16-200

转染细胞的β-gal原位染色

1.该实验过程用于检测固定细胞中的β-gal表达。这是确定转染效率的便捷方法。该方法在从Sanes方法修改而来的6孔板上执行。对于不同大小的培养皿,根据培养板的表面积比例扩大或减少溶液量。此步骤可用于悬浮细胞。使用2×106转染的细胞(来自6孔板转染),轻轻离心细胞,并使用与培养板相同的方法冲洗细胞。轻柔地处理细胞,不要摇晃,并以尽可能低的速度离心。

液体存储:

将20mg / ml X-gal溶于二甲亚砜(-20℃,储存在聚丙烯试管中,避光)。

注:使用玻璃移液器或聚丙烯尖端对二甲基亚砜溶液进行定量。二甲基亚砜可以溶解聚苯乙烯。

50mM铁氰化钾(储存于4℃)。

质粒转染细胞步骤_质粒转染浓度_质粒转染

50mM亚铁氰化钾(在4℃下储存)。

工作液:

定性溶液:含2%甲酰胺,0. 05%戊二醛D-PBS(在4℃储存)

制备方法如下:

85ml蒸馏水

不含钙和镁的10毫升10X D-PBS(货号14200-07 5)(27mM KCl,11mM KHPO4,1. 4mM NaCl质粒转染浓度,81mM Na2HPO4·7H2O)

5ml福尔马林(37%甲醛溶液)

0. 2ml戊二醛(25%溶液)

染料溶液:D-PBS含有5mM铁氰化钾,5mM亚铁氰化钾,2mM氯化镁(在4°C下储存)。

制备方法如下:

70ml蒸馏水

10ml 10×D-PBS

10ml 50mM亚铁氰化钾

10ml 50mM铁氰化钾

0. 2ml 1M氯化镁

底物/染料溶液:染料溶液中含有1mg / ml X-gal

以下试剂可供使用:

20ml染料溶液

1ml X-gal(20mg / ml)

步骤:

1.用质粒pCMV·SPORT-βgal转染并表达超过24小时。

2.每孔用2ml含钙和镁的D-PBS洗涤细胞一次(货号14040-13 3)。

质粒转染_质粒转染细胞步骤_质粒转染浓度

3.在室温下用1ml固定剂固定细胞5分钟。

4.用2ml D-PBS清洗每孔两次。

5.向每个孔中加入1ml底物/染料溶液,并在室温或37°C下孵育2小时至过夜。

6.在每个孔中加入2ml D-PBS冲洗,在倒置显微镜下观察细胞,并估计蓝色细胞(β-gal阳性)的比例。

7.为了保存培养板,向每个孔中加入1ml含10%福尔马林的PBS,并在室温下放置10分钟。用D-PBS冲洗并在4°C下储存在PBS中。

测定转染细胞提取物中β-gal的表达

该实验方法用于确定细胞提取物中的β-gal活性。可以测量从96孔板转染到100mm培养皿中获得的活性。此方法可以应用于悬浮细胞(有关注释,请参阅步骤2)。

解决方案

裂解液:0. 1%Triton X-100 / 0. 1M Tris-HCl(pH 8. 0)。

450毫升蒸馏水

50ml 1M Tris-HCl(pH 8. 0)

0. 5毫升Triton X-100洗涤剂

100×Mg溶液

0. 1M氯化镁

4. 5M 2-巯基乙醇

保存在4℃

0. 1M磷酸钠(pH 7. 5)

41ml 0. 2M Na2HPO4

9ml 0. 2M NaH2PO4

50ml蒸馏水

将4mg / ml ONPG(邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷)溶解在0. 1M磷酸钠中,该磷酸钠含2mM 2-巯基乙醇(pH 7. 5),在4℃下储存)。

1M碳酸钠水溶液

质粒转染浓度_质粒转染_质粒转染细胞步骤

使用GENETICIN®筛选抗生素以筛选稳定的转染菌株

进行筛选所需的GENETICIN抗生素的量将随细胞类型,培养基和血清成分而变化。另外,如果您使用的是粉末状的GENETICIN抗生素,则由于滴度会波动,因此需要计算每批抗生素的剂量。或使用GENETICIN抗生素溶液,其活性将为100%。

通常,使用浓度为100至1100μg/ ml的GENETICIN抗生素来选择稳定的转染菌株,并使用所选剂量的一半来维持培养抗性。转染前,使用细胞进行剂量反应分析,以确定杀死细胞的最低抗生素浓度。稍高的浓度可用于筛选稳定的转化子。

储备液的制备:50mg / ml

1.样本计算:

标签滴定度:700μg/ mg

要制备10毫升质粒转染浓度,需要500毫克活性药物。因此,所需的总干重为714毫克。

2.重714毫克的GENETICIN抗生素。

3.溶于10毫升蒸馏水中。

4.无菌过滤。

或者,您可以使用滴定度为50mg / ml的活性抗生素的即用型溶液(无菌过滤)。

剂量反应分析:

1.准备不含青霉素或链霉素的完全培养基。

2.加入0至22μl50mg / ml的GENETICIN抗生素溶液(终浓度为0至1100μg/ ml的完全培养基,以100ug / ml的梯度递增)。

3.用胰蛋白酶消化细胞并稀释至4000细胞/ ml。

4.在6孔板的每个孔中加入100μl细胞悬液,并向每个孔中添加2ml含有稀释的GENETICIN抗生素的培养基。将培养板在加湿的5%CO2中于37°C孵育。每周两次用含有GENETICIN抗生素的新鲜培养基更换培养基。

5. 10到14天后,移出培养基,并用含有钙和镁离子的D-PBS洗涤细胞。将细胞用溶于50%甲醇的0. 5%亚甲蓝染色20分钟。

6.确定杀死所有细胞的最低浓度的GENETICIN抗生素。使用下一个较高的浓度进行筛选。

转染和筛选:

1.用含有抗生素抗性基因表达序列的质粒(例如pSV2neo)转染细胞。

2.转染后的第二天,向下传递细胞以提供细胞分裂的空间(取决于细胞的生长速度,通常可以达到1:10至1:40的效果)。

3.转染后2-3天,开始使用抗生素。将转染的细胞培养在含有抗生素的培养基中,并通过剂量反应分析确定抗生素的浓度。每周两次更换含有抗生素的培养基。

4. 10到14天后,可以观察到抗性克隆,并且未转染的对照应该没有细胞生长。耐药细胞可以根据需要进行固定,染色,传代或克隆。

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