经验总结:关于细胞转染的那些事情

对于细胞实验新手来说,细胞转染是一个令人难过的障碍。如果细胞转染率低,则可能必须丢弃您的珍贵细胞。

众所周知幸运快三 ,细胞是由带负电荷的磷脂双层构成的,它是对大分子物质(例如DNA和RNA的磷酸盐骨架)的不可渗透的屏障。为了使核酸穿过细胞膜,发展可以将多种技术大致分为物理介导,化学介导和生物介导。

几种常见的转染方法:

1、脂质体转染方法

阳离子脂质体在表面上具有正电荷,并且可以与核酸的磷酸酯相互作用以将DNA分子封闭在内部银河国际 ,从而形成DNA脂质体。它也可以被表面带负电荷的细胞膜吸收,然后通过融合或细胞内吞入细胞吸收。脂质体转染适用于将DNA转染到悬浮或粘附的培养细胞中。它是目前实验室中最方便的转染方法之一,其转染率高于磷酸钙法。

2、磷酸钙共沉淀法

这种方法的重现性很差,磷酸钙溶液对温度,pH和缓冲盐浓度的变化非常敏感,并且对细胞特别是原代细胞有毒。无法使用RPMI培养基,因为它含有高浓度的磷酸盐。

3、电穿孔转染方法

电流可以可逆地穿透细胞膜形成瞬时孔,从而促进DNA分子进入细胞。这种方法是电穿孔。

当某些脂质体的转染效率非常低或几乎无法转移时,可以使用电穿孔进行转染。

在正常情况下,高电场强度会杀死50%-70%的细胞。已经开发出一种用于细胞死亡的电保护剂,可以大大降低细胞死亡率并提高电穿孔的转染效率。

4、病毒感染

对于无法通过脂质体或电穿孔成功转染的细胞系,可以使用病毒感染。腺病毒,腺伴随病毒,逆转录病毒和慢病毒载体已在体内和体外广泛用于哺乳动物细胞。转染效率较高,适合转染较困难的细胞。

但是,插入片段的长度是有限的。最重要的是,技术难度相对较高,并且很难在普通实验室中普及,并且某些病毒起效缓慢并且无法跟上细胞的快速繁殖速度。有效转染简单细胞系。

没有一种方法适合所有细胞和实验。应根据细胞类型和实验需要选择理想的方法。如果在细胞水平上进行并且使用简单的细胞系,那么脂质体转染通常是一个好方法。

因此,我们将主要讨论脂质体转染:

进行实验之前,请先计划好实验。通常,细胞转染需要24h-72h,因此您必须充分了解细胞的生长速度,计算所需的脂质体和DNA储备yabo2020 ,并确认以下材料足够:Opti-MEM无血清培养基,Lipofectamine转染试剂,和DNA。这必须得到证实,否则就没有办法责怪别人生气。

做好上述准备后,具体步骤如下:

1、细胞电镀

(1)通常选择使细胞复苏3-4次(在融合率达到90%之前先通过细胞,不要生长到100%),并从融化过程中恢复可以稳定生长的细胞用于细胞转移当传代次数多时(> 30-4 0),细胞的生长速率和形态会发生变化。

(2)如果您提取总蛋白,通常选择六孔板进行转染,因为从转染细胞中提取的蛋白总量可以达到200ug,通常就足够了,所需的DNA和脂转染胺相对较少。

(3)传代条件取决于所使用的细胞系。对于快速生长的细胞,倍增时间为16小时(例如HEK29 3)。对于缓慢生长的细胞,倍增时间为36小时(例如作为主要细胞)。

(4)在转染当天,将细胞铺板。如果将细胞在转染前一天或更早的时间内铺板,则转染效率可能会降低。如果是简单的细胞系转染质粒转染浓度,则可以直接铺板过夜转染在第二天进行,在转染过程中,细胞密度会影响转染效率,细胞密度应保持在70-90%的融合率(前提是转染为24h,如果转染为48h ,汇合率为50-70%),细胞接种和转染也可以同时进行。

2、细胞转染

吸出培养皿中的培养基,并用PBS或无血清培养基洗涤一次。更换无血清培养基。制备转染制备液,并用无菌EP管制备。

以六孔板为例,溶液A:用200μlOpti-MEM稀释4μg质粒;溶液B:用200μlOpti-MEM稀释10μllipo2000,轻轻混合A溶液和B溶液,静置5分钟。将B溶液移入A溶液中质粒转染浓度,轻轻混合,然后在室温下静置20分钟。

将转染试剂添加到每个孔的培养基中。 6小时后,更换为完全培养基,继续培养24-48小时(不同的质粒和脂质体的最佳比例不同。转染前,应找到最佳比例。质粒:脂质体= 1:1,1:1. 5 ,1:2、1:2. 5、1:3、1:3. 5梯度比检测最佳转染率通常质粒具有荧光,可通过观察各组的强度来判断转染效率的荧光)。以下是需要添加到不同规格培养板中的DNA和lipo2000的量。

转染时,应使用高质量质粒:

1、通过测量OD值确定DNA纯度和浓度。测得的OD值应在1. 7- 1. 9之间。脂质体转染基于电荷吸引原理。如果DNA不纯净,例如少量的盐离子亚博买球 ,蛋白质和代谢产物污染,它将显着影响转染复合物的有效形成和转染的进程。

2、含有内毒素的质粒对细胞毒性很大。

在转染过程中,小心轻柔地将lipo2000添加到培养基中并轻轻混合,以免造成剧烈而剧烈的吸液,这会导致脂质体失效。

曾经有人认为血清会降低转染效率。老一代的转染方法通常需要在转染前后用PBS洗涤细胞,然后在无血清培养基中转染它们,但是某些敏感细胞会受到损害。 ,甚至死亡(例如粘附不良的细胞,当用PBS洗涤时很容易被洗掉)导致极低的转染效率。

但是,如今在转染产品配方的几项创新之后,对于主流转染试剂而言,血清的存在不再影响转染效率,甚至有助于提高转染效率,但是血清的存在将影响DNA转染的形成。当DNA转染复合物形成时,复合物需要无血清培养基opti-MEM来稀释DNA和转染试剂。血清可用于转染过程。

转染后6小时更换培养基,因为lipo2000具有一定的毒性。

通常在细胞培养过程中添加抗生素以防止污染,但是抗生素可能会引起转染问题。例如,青霉素和链霉素。青霉素是我们经常用来防止污染的抗生素,这会影响转染。尽管这些抗生素通常对真核细胞无毒,但当转染试剂增加细胞通透性时,当发生性行为时,抗生素也会进入细胞,间接导致细胞死亡,从而降低转染效率。

目前,某些转染试剂可以在含有血清和抗生素的完全培养基上进行全过程操作,非常方便,并且节省了污染的麻烦。

3、观察转染的效果

转染后24小时,用荧光显微镜观察实验结果并记录荧光蛋白的表达。如下图所示,表明转染成功,转染效率合格。如果没有荧光,则可以使用GFP进行纯化。将对照置于单独的孔中,或与目标质粒共转染,并同时通过Q-PCR和WB检测。

转染后,发现转染效率不高。有两种方法可以做到:

1、如果细胞对脂质体具有良好的耐受性,并且转染后的细胞死亡数量相对较小,则进行转染,即转染后12-24小时进行转染。

2、通过药物筛网杀死失败的细胞。前提是该质粒带有抗生素抗性基因。

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