质粒转染操作步骤及注意事项

质粒转染是哺乳动物细胞蛋白表达和昆虫细胞表达中的关键步骤。转染的效率直接影响整个实验的成功或失败。本文介绍了昆虫细胞扩增P1转染和293细胞试验转染的具体操作步骤和转染和ExpiCHO细胞转染的实验系统,以及我们为提高质粒转染效率而编写的一些预防措施,供您参考。

1、昆虫细胞扩增P1转染:

(1)细胞状态良好,存活率超过98%,对数生长期细胞分布在六孔板中,孔数为900,000 /孔;

(2)在27°孵育30分钟,然后在完全粘附后转染;

([3)转染系统

转染缓冲液

粘粒

转染试剂(lipo200 0)

200 ul

10 ug

10 ul

注意:首先将质粒添加到转染缓冲液中,然后添加转染试剂

(4)在室温下孵育30-45分钟;

(5)孵育后,滴加到预先放置的六孔板上;

(6) 4-6天后收集的上清液是P1代病毒;

注意:将质粒在室温下预热,然后将转染试剂和培养基在37度下预热。

2、 293细胞的小规模转染:

(1)前一天采集的细胞状况良好,存活率超过98%,对数生长期细胞稀释至1x10 ^ 6细胞/ ml;

([2)转染当天的细胞数1. 8- 2. 2 x10 ^ 6细胞/ ml细胞处于良好状态上海快三 ,转染存活率在98%以上;

([3)转染系统

转染量

缓冲溶液

粘粒

转染试剂(PEI)

90毫升

10毫升

100 ug

300 ul

(4)混合均匀并在37°C下孵育20分钟;

(5)孵育后,倒入预分裂的细胞中,均匀摇动并在37度下培养;

([6)第二天添加TN13毫升/ 100毫升;

(7) 4至6天后,收集上清液或细胞用于下游实验,收集4天用于细胞内表达,收集6天用于细胞外表达,以5000 rpm的速度离心10分钟,并分别沉淀上清液;

注意:在转染过程中,一个实验,一个过滤器和一个离心管是完全独立的,以避免交叉污染;质粒在室温下预热,转染试剂和培养基在37度下预热

3、 ExpiCHO细胞转染:

(1)前一天采集的细胞状态良好,存活率超过98%,对数生长期的细胞稀释至3-4 x 10 ^ 6细胞/ ml;

(2)转染当天,细胞计数为7-9 x10 ^ 6细胞/ ml。细胞状况良好质粒转染浓度,存活率达98%以上。将细胞稀释至6 x10 ^ 6细胞/ ml;

([3)转染系统

转染量

缓冲区OPI

粘粒

转染试剂专用

25毫升

75毫升

25 ug

75 ul

注意:首先将质粒添加到转染缓冲液中,然后添加转染试剂。将质粒在室温下预热,并在4度下使用转染缓冲液和转染试剂。

(4)充分混合并在室温下孵育1-5分钟;

(5)孵育后,倒入预分裂的细胞中,均匀摇动并在37度下培养;

(6)第二天添加Enhance150 ul饲料6ml;

(7)在8-10天后收集上清液或细胞用于下游实验;

注意:在转染过程中,一台,一台过滤器和一根离心管是完全独立的亚博全站 ,以避免交叉污染

4、质粒转染的一些注意事项

(1)。细胞密度

细胞接种和转染最好在同一天进行。一般而言,当细胞密度达到70%至90%时,转染可以获得更高的转染效率。太低或太高都会影响转染效果。

([2)单元状态

这是核心。在许多情况下,传代次数过多或太少都会导致细胞对转染试剂的敏感性发生变化。因此,为了提高转染效率,转染稳定性并降低细胞毒性,有必要尽可能使用中等传代的细胞系,并在不同实验中保持细胞传代数的一致性。通道尝试确保细胞均匀分布且密度合适。如果细胞的不均匀分布导致细胞聚集或通过密度太高,则单个细胞与培养基之间的接触面积将减少,脂质体进入细胞的可能性将降低。这导致质粒转染效率低。

其次,尝试选择没有支原体污染的细胞。目测不能检测到支原体污染,这严重影响了质粒转染的效率。可以使用支原体检测试剂盒对其进行测试,以确保没有支原体污染。

(3)。单元格类型

转染细胞时,不同的细胞类型需要不同的转染系统。一种系统不能用于所有类型细胞的转染实验。如上所示,我们使用了三种不同的转染系统进行昆虫细胞转染,293细胞试验转染和ExpiCHO细胞转染。

([4) DNA纯度

制备高纯度DNA时,还必须从DNA中去除内毒素。内毒素的存在会引起细胞毒性并严重影响转染效率。因此,当我们进行质粒转染时,对于递送的质粒,我们有以下要求:递送的质粒应溶于TE(10 mM Tris-HCl,1 mMEDTA)中,A260 / A280的比例在1. 8- 2. 0,质粒浓度约为1000 ng / ul

①内毒素小于0. 128 eu / ug

②大规模质粒提取的要求:无内毒素,无酚凤凰体育 ,无氯化钠

③需要通过电泳鉴定质粒,超螺旋质粒的含量大于50%质粒转染浓度,且无明显蛋白污染。

(5)。转染试剂

转染试剂的原理是高效yabo2020 ,低毒,方便和低成本。每种转染试剂将提供一些成功转染的细胞系和文献的清单。通过这些数据,您可以选择最适合实验设计的转染试剂。

简而言之,尽管质粒转染是一项基础实验,但要做好这项工作还需要很多思想。中鼎生物愿意与大多数科研人员交流经验。欢迎咨询

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